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实验室基础操作
LB混合粉末组成成分
- 胰蛋白胨Tryptone：蛋白水解产物，为细菌提供氨基酸和其他生长因子
- 酵母提取物Yeast Extract：含有丰富的维生素、氨基酸、矿物质等，为细菌提供生长所需的营养
- 氯化钠NaCl：调节渗透压，帮助维持细胞内外的平衡 ps. 实验室仅需从公司定制的一种黄色混合粉末配置液体培养基即可
LB液体培养基的配置步骤
1. 配置液体培养基，洗净六个大锥形瓶（2L）和一个1000mL的大量筒，清洗步骤是先用清水完全冲洗（可开大水量）再用纯水冲洗内壁
2. 用大量筒在每个大锥形瓶中倒入约1L的纯水
3. 将滤纸对折后平铺在电子天平上，称取约25g的粉末，倒入大锥形瓶中，尽量不要碰到内壁，而且在倒粉末最后轻弹滤纸，尽可能将所有粉末都倒入大锥形瓶中。重复六次。注意每张滤纸最多重复使用两次
4. 用锡箔纸将大锥形瓶封口压紧，并标注名字缩写等可辨认的记号
5. 将六个大锥形瓶放入高温高压灭菌锅进行高压灭菌，处理120℃，20分钟
ps. 高温高压灭菌锅使用方法：先把两个铁架子都拿出来，观察水位是否没过圆盘上的所有圆洞，若没有，就往里面加纯水，观察旁边的管子水位是否位于中间，若偏高则需要用小水桶向外放水。准备工作完成后将一个铁架子放进去，再放入六瓶锥形瓶，注意要扎紧口，瓶子可以斜放、摞起来放，但瓶口必须向上。不再放第二个铁架子，直接把机器盖子压好，上锁，运转。
6. 最后将大锥形瓶放入柜子常温保存即可
转化
转化实验指的是将外源DNA（如质粒DNA）引入受体细胞（通常是大肠杆菌）中，使细菌获得新基因。
所需材料
- 感受态细胞（常用大肠杆菌，如DH5α、BL21等），该实验中使用的是BL21（DE3）
- 质粒DNA
- 冰
- 42℃水浴
- 抗生素（如氨苄青霉素、卡那霉素等，取决于质粒的抗性）
- LB液体培养基
- 抗生素选择培养基的LB平板
- 无菌枪头、移液器、无菌离心管
实验步骤（浓度、时间根据实验需要调整）
- 制备感受态细胞 ps. 已从公司购买，此处跳过
- 解冻感受态细胞
- 从冰箱中取出感受态细胞，放置在冰上解冻（如果是直接使用的即刻解冻，保证其低温状态）
- 混合质粒DNA与感受态细胞
- 取50-100微升感受态细胞，加入到预先冷却的无菌1.5mL离心管中
- 加入 约1微升质粒DNA（轻轻反复抽吸，混合均匀），轻轻混匀（避免剧烈混匀，以防损伤细胞）
- 测混合物浓度，该实验需要大概200ng/微升左右（不能太高浓度，不然取液体积太小不好操作）
- 将混合物静置在冰上约10min（使DNA与细胞充分接触）
- 热激处理
- 将冰上的混合物迅速放入42℃水浴中，热激60s（使细胞膜暂时开放，利于DNA进入）
- 热激后将管子放回冰上冷却
- 回复培养
- 加入 700-800微升无抗生素的温室温LB培养基
- 在37℃摇床中培养40分钟，允许细胞恢复生长并表达抗性基因
- 细胞涂布平板（在超净工作台上操作）
- 先点燃酒精灯，再取100微升恢复培养的菌液，均匀涂布于含有相应抗生素的选择性LB平板上 ps. LB平板制作：固体LB培养基，趁热（只有热时候才是液体）倒在平板上，并倒置
- 如果菌液浓度较高，可以稀释一定倍数后再涂板，以便形成合适的菌落数 ps. 1. 本实验中购买使用两种质粒，一种人的，一种大肠杆菌的，所以需要涂布两个平板 2. 超净工作台使用：关上紫外灯，打开电源和风机，点燃酒精灯，在酒精灯旁进行操作，该灭菌的要在酒精灯旁灭菌，实验中不要离开工作台，不要伸到罩子以外。使用后关电源关风机开紫外再离开
- 孵育
- 将平板倒置放入37℃二氧化碳培养箱中过夜（14个小时左右）
- 经过选择抗生素筛选的细菌菌落表示成功转化
- 挑菌落（在超净工作台上操作）
- 拿出两个平板，取八个无菌盖试管，分别向其中加入200微升的添加抗生素的液体LB，用100微升的枪头挑细菌，轻触平板上比较完好且相对独立的菌落，反复在溶液中吹洗（只需按到第一档），直到枪头上没有白色物。注意全程不要将菌落沾在壁上。转入人质粒的菌落挑入四个无菌盖试管，转入大肠杆菌质粒的菌落挑入四个无菌盖试管，每个试管中仅需一个菌落
- 将八个无菌盖试管放入37℃、200rmb摇床，4小时保存。注意要等到摇起来后再离开
- 作者:Larry
- 链接:https://www.larryivanhan.blog/article/preparation_of_lb
- 声明:本文采用 CC BY-NC-SA 4.0 许可协议，转载请注明出处。