测序基本原理 | Larry’s Space

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Sanger测序——第一代测序

Sanger测序，也称为链终止测序，是一种经典的DNA测序方法，通过引入特定的“终止”核苷酸（ddNTP），阻断DNA链的延伸，从而能够逐步解析DNA的碱基顺序。这种方法尽管速度较慢，但在短序列测定上具有极高的准确性。

技术原理及简要步骤

步骤 1：DNA模板的准备与扩增

目标DNA片段通常需要经过PCR扩增以获得足够的量，确保反应体系中有充足的模板DNA。

此外，目标片段应该是单链的，这样可以让单链模板用于后续反应。

步骤 2：引物结合

选择一个已知序列的DNA引物（短DNA片段），并将其与DNA模板的一端结合。这个引物是DNA合成的起始点。

DNA聚合酶会从引物开始，向3’方向延伸DNA链。

步骤 3：反应混合物准备

将实验分成四个独立的反应试管，每个试管中包含：

四种常规核苷酸（dNTP：dATP、dTTP、dGTP和dCTP）：这些是正常的碱基，用于延伸DNA链。
一种特定的双脱氧核苷酸（ddNTP：ddATP、ddTTP、ddGTP或ddCTP）：ddNTP每个试管只加入一种，带有不同的荧光标记。ddNTP的特殊结构导致它一旦被添加到DNA链上，链的延伸便会终止。
DNA聚合酶：一种催化核苷酸依次添加到DNA链末端的酶。

p.s.

ddNTP分子缺少3’羟基（-OH），使其无法再添加新的核苷酸，因此加入ddNTP会使链的延伸中断。由于每个试管的ddNTP不同，生成的DNA片段长度各异，每个片段的末端都由特定的荧光ddNTP标记。

步骤 4：链延伸与终止反应

在DNA聚合酶的作用下，dNTP和ddNTP被随机加入到链上。每当ddNTP偶然掺入，链的延伸便会停止。

随着反应进行，形成了许多不同长度的DNA片段，每个片段末端代表一个特定的碱基（A、T、G或C）的荧光标记。

步骤 5：电泳分离与检测

将每个反应试管中的产物加入电泳凝胶中，利用电泳将片段按长度大小分离。短片段在电泳过程中移动得更快，而长片段移动较慢。

通过激光等检测装置读取荧光信号，识别每个片段末端的ddNTP类型，由此得到每个碱基的序列顺序。

技术优势与局限性

优势：

Sanger测序精度极高，是验证小片段DNA序列的首选方法。

适用于小规模测序（如单个基因或小片段的测序）。

局限性：

每次只能读取大约800-1000个碱基，对于大型基因组测序效率较低。

成本较高，时间较长，不适合大规模或全基因组测序。

下一代测序NGS（第二代测序，以Illumina为例）

Illumina测序技术（Illumina Sequencing Technology），亦称为高通量测序或下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS），是目前应用最广泛的基因组测序平台之一。Illumina测序基于“合成测序”（Sequencing by Synthesis, SBS）原理，通过在固相支持物（Flow Cell）上进行桥式扩增，形成大量的簇（Clusters），然后通过逐碱基合成和荧光成像来确定碱基序列。其核心优势在于高通量、准确性高、灵活性强，适用于多种测序应用。

样本准备

1. DNA片段化

将高分子量的DNA或RNA剪切成适合测序的片段，通常在200-600 bp之间。通常的方法包括使用Covaris设备通过高强度超声波将DNA剪切成所需长度或者使用特定的核酸酶进行片段化（通常用于RNA测序）。

2. 文库构建

末端修复（End Repair）：将DNA片段的末端转化为平末端（blunt ends），以便后续步骤。通常使用DNA聚合酶和/或内切酶修复片段末端，使其具有平整的3’和5’末端。

A尾添加（A-Tailing）：在DNA片段的3’末端添加一个腺嘌呤（A）碱基，为连接接头（adapter）做准备。通常使用Taq DNA聚合酶在3’末端添加单个A碱基。

接头连接（Adapter Ligation）：在DNA片段两端连接Illumina测序所需的接头序列，这些接头包含测序引物结合位点和条形码（Barcode）序列。连接这些接头可以通过T4 DNA连接酶。根据文库构建策略，选择单末端（single-end）或双末端（paired-end）接头。

文库富集与纯化（PCR Enrichment and Purification）：通过PCR扩增增加文库的浓度，并去除未连接接头的片段。

簇生成

簇生成是将文库中的DNA片段扩增成大量相同的拷贝簇，每个簇来源于一个单一DNA分子，以便进行高效的测序反应。簇生成主要包括以下步骤：

1. 流式细胞加载（Flow Cell Loading）

流式细胞是Illumina测序的核心组件，通常由玻璃片组成，表面覆盖有特定的引物。

加载方法：

混合文库：将文库按照推荐浓度稀释后，加载到流式细胞的不同通道（lanes）中。

使用混合文库和桥式扩增试剂：确保文库均匀分布在流式细胞表面。

2. 桥式扩增（Bridge Amplification）

桥式扩增是在流式细胞表面进行的局部PCR扩增过程，将文库片段固定在流式细胞表面的引物位置，并通过热循环使其形成桥状结构，进而扩增成簇。

固定片段与引物结合流式细胞表面覆盖有两种互补的引物，分别对应文库接头的两端（P5和P7）。文库片段通过接头序列与流式细胞上的引物互补结合。

桥式结构形成通过温度变化使单链DNA片段与相邻的引物发生自我配对，形成桥状结构。使用DNA聚合酶在桥状结构上延伸，形成双链DNA。然后用碱溶液洗去非共价键连接的一条链。

通过多轮热循环，使每个桥状结构在流式细胞表面扩增成一个由数千个相同DNA分子组成的簇。

最后，通过特殊反应切掉并且洗去反向链，只留下正向链。

合成测序（Sequencing by Synthesis, SBS）

1.核苷酸加入（Nucleotide Incorporation）

试剂组成：

可逆终止核苷酸（RTNs）：包括四种带有不同荧光染料的核苷酸（dATP, dTTP, dCTP, dGTP），每种核苷酸都携带一个可逆的阻断基团（通常是酰胺基）。
DNA聚合酶：负责催化核苷酸的加入，常用高保真度的聚合酶，如Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。
缓冲液：维持反应的pH值和离子强度，确保聚合酶的活性和核苷酸的有效性。

2.碱基延伸（Extension）

在DNA聚合酶的催化下，RTNs被添加到模板链的3’端，形成新的双链DNA。由于阻断基团的存在，每个簇只能在每个循环中添加一个核苷酸，确保测序的准确性。形成的双链DNA桥在流式细胞表面固定，准备下一步的测序反应。

3.荧光成像（Imaging）

使用特定波长的激光激发带有荧光染料的RTNs。每种核苷酸带有不同颜色的荧光染料（如A-T-红色，C-T-绿色，G-T-蓝色，T-T-黄色）。捕捉每个簇的荧光信号，记录下当前循环中加入的碱基类型。通过专用软件将荧光信号转换为具体的碱基序列信息。

4.荧光染料与阻断基团去除（Dye and Blocking Group Removal）

通过化学方法（如碱性条件）将RTNs上的荧光染料从DNA链上去除，避免对下一循环的荧光信号产生干扰。去除后，DNA链的3’端恢复为开放状态，准备下一轮的核苷酸加入。

5.循环上面步骤，循环次数视序列长度而定

数据处理

可以发现Illumina测序只能测出一些短片段，所以需要Reads Mapping等数据处理手段，之后我们会介绍。